Tecniche molecolari applicate al monitoraggio aerobiologico

L’esigenza di approfondire i dati del monitoraggio aerobiologico porta Arpa Valle d’Aosta ad esplorare  tecniche alternative alla microscopia ottica. I metodi tradizionali di identificazione microscopica dei funghi e delle spore fungine aerodisperse, basati su tecniche colturali, sottostimano inevitabilmente la biodiversità presente, in quanto solo il 17% dei funghi conosciuti può crescere su un terreno colturale, e di questi molti producono un micelio sterile. L’analisi microscopica dei vetrini di monitoraggio rileva, invece, in maniera più fedele, la biodiversità presente nel campione. Tuttavia, molte spore non possono essere distinte le une dalle altre in base alla loro morfologia e, in ogni caso, è possibile giungere  solo fino alla determinazione del genere.

I metodi molecolari, basati sulla tecnica della PCR Real Time, hanno il vantaggio di rilevare la presenza dei microrganismi nel campione, indipendentemente dalla loro coltivabilità. Riducono, inoltre, drasticamente i tempi analitici e sono caratterizzati, quando ben costruiti, da elevata sensibilità e specificità.

Il lavoro, svolto presso il laboratorio di microbiologia, ha il duplice  scopo di giungere alla determinazione quali-quantitativa delle spore fungine aerodisperse (generi Alternaria e Cladosporium), tramite l’amplificazione del DNA target (Real-time PCR) e di raccogliere la biodiversità presente sui vetrini di biomonitoraggio.

La PCR  è stata eseguita  su campioni di pollini di nocciolo, raccolti direttamente dalle infiorescenze, e su campioni di Alternaria spp. e Cladosporium spp., coltivati su piastra, con lo scopo di mettere a punto il protocollo di estrazione e di amplificazione del  DNA. Successivamente ne è stata verificata l’applicabilità sui vetrini  del monitoraggio aerobiologico.

I risultati ottenuti  fino ad ora indicano che è possibile, con il metodo messo a punto  nel laboratorio dell’Arpa Valle d’Aosta, rilevare i  pollini raccolti da vetrino di monitoraggio simulato (i pollini sono stati a contatto con la fucsina per poche ore) fino ad una concentrazione di 104 pollini/vetrino (corrispondenti  a circa 103 pollini/reazione).

Il  metodo, comprendente l’estrazione del DNA e la sua amplificazione, applicato alle spore fungine, ha dimostrato buona efficienza, specificità, riproducibilità e sensibilità, in particolare per la rilevazione di Cladosporium spp. (102 spore/reazione). Per  Alternaria spp. sono state evidenziate alcune criticità, probabilmente dovute alla fase di estrazione e purificazione dell’acido nucleico. La sua applicabilità sui vetrini del monitoraggio aerobiologico, dopo colorazione con fucsina, non è stata dimostrata.

Vai alla presentazione Tecniche molecolari applicate al monitoraggio aerobiologico a cura di Francesca Borney di Arpa Valle d’Aosta

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